بررسی کینتیکی مهار شدن آلکالین فسفاتاز

سوبسترای اختصاصی آلکالین فسفاتاز هنوز آشکار نشده است و این آنزیم در بافتهای مختلف پستانداران به مقدار زیاد وجود دارد (morton .,et al (2003)). معمولاً اثرات جانبی داروهایی که مورد استفاده عموم میباشند، به طور کامل مشخص نشده است. تاکنون تاثیر چند داروی محدود بر روی آنزیم آلکالین فسفاتاز مطالعه شده است. همچنین اثرات کینتیکی برخی از داروها بر این آنزیم مشخص شده که از جمله میتوان تأثیر داروهای لانزوپرازول و وانادات را ذکر کرد که به ترتیب اثرات مهارکنندگی غیررقابتی و رقابتی بر آنزیم آلکالین فسفاتاز دارند.لانزوپرازول مهارکننده گروه فسفات است که با استفاده از tnap ایزوله شده نشان داده شد که اثر غیر رقابتی بر روی آنزیم آلکالین فسفاتاز دارد. لانزوپرازول برای درمان آرتریت استخوان و در درمان بیماری gasteroeso reflex disease به کار می رود . (roberts., et al (2006)) در تحقیقی دیگر که توسط دکتر محمد شیرازی و همکارانش آنجام دادند ? اثر 1میلی مولار وانادات بر روی آنزیم آلکالین فسفاتاز را در ph=7.5 با km=0.1mm بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که با اضافه کردن مهارکننده وانادات به آنزیم آلکالین فسفاتاز در همین ph مقدار ثابت کینتیکی تغییریافت و به کمتر از 5میلی مولار رسید. (shirazi et al., 1981) در تحقیقی دیگر دکتر چن و همکارانش اثر فسفوناتها و آنالوگهای فسفات را نیز بر روی آنزیم آلکالین فسفاتاز در ph=7.5 بررسی کردند. آنالوگهای فسفات عبارتند از: phenylene- 1,3-diphosphonate?2,6- dinitrophenylphosphonate وphosphonoasetaldehyde این آنالوگها به عنوان مهارکننده های رقابتی آنزیم آلکالین فسفاتاز شناخته شدند که دارای مقادیر km با رنج های 16-18m می باشند. (chen et al., 1996) در تحقیقی دکتر فاطمه فولادی و همکارانش در سال 2004 میلادی اثر کریستال هروئین را بر روی آنزیم آلکالین فسفاتاز بررسی کردند.همانطور که می دانیم کریستال شکل خاصی از هروئین است و مصرف آن موجب عوارض خاص کبدی می شود.بنابراین ارزیابی آنزیم آلکالین فسفاتاز می تواند برای ارزیابی اثرات زیان بخش این ماده مخدر مفید می باشد و به این نتیجه رسیدند که ارتباط معنی داری بین اثر کریستال و مقدار آنزیم آلکالین فسفاتاز وجود دارد.به این معنی که کریستال هروئین باعث کاهش عملکرد آنزیم آلکالین فسفاتاز می شود. در این تحقیق همانطور که بیان گردید، مطالعات کینتیکی و مولکولی اثر داروی ترامادول بر روی آنزیم آلکالین فسفاتاز کلیهی موش سوری صورت گرفته است. در بررسی کینتیکی آنزیم آلکالین فسفاتاز، با توجه به نمودارهای میکائیلیس – منتن و لنیویور – برک ترسیم شده، اثر ترامادول، اثری مهاری تشخیص داده شد. بدین صورت که ترامادول سبب کاهش سرعت ماکزیمم آنزیم آلکالین فسفاتاز کلیه ی موش شده و اثر مهارکنندگی غیر رقابتی برآنزیم آلکالین فسفاتاز دارد. در این بررسی به کمک نمودار لینویور-برک km=0.282mm محاسبه گردید.برای محاسبه ی ki از روش دیکسون استفاده شد.با کمک این روش تاثیر غلظتهای مختلف از مهار کننده بر کینتیک آنزیم آلکالین فسفاتاز در غلظتهای مختلف از سوبسترا،بررسی گردید.همانطور که ذکر گردید ic50=0.1mmبه دست آمد.بدین معنا که در غلظتی برابر0.1mm از ترامادول 50?از فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز مهار می شود. در مطالعات ساختمانی، تغییرات ساختاری که داروی ترامادول به هنگام اتصال بر ساختمان سومآنزیم آلکالین فسفاتاز کلیهی موش اعمال میکند، توسط دستگاه فلورسانس مورد بررسی قرار گرفت. در این بخش مطالعات ساختاری مربوط به تغییرات ساختار سوم آنزیم آلکالین فسفاتاز در اثر مواجه با داروی ترامادول به وسیلهی دستگاه فلورسانس، که برانگیختگی در طول موجهای 275 نانومتر (مربوط به اسید آمینه تیزورین) و 280 نانومتر (مربوط به اسید آمینه تریپتوفان) مورد بررسی قرار گرفت، تغییرات ساختاری ملاحظه شد. بلند بودن پیک نشر در طول موج 275 نانومتر در آنزیم خالص بر این مسئله تأکید دارد که زیر واحدهای تیروزین در درون پروتئین و در محیطی غیرقطبی قرار دارند. زمانی که سوبسترا به آنزیم افزوده میشود، شدت فلورسانس کاهش و طول موج نشر آن افزایش مییابد که سبب کوئنچینگ شده و موکد به سطح آمدن تیزورینها میباشد. در نتیجه میتوان گفت که پس از اتصال سوبسترا، اسید آمینههای تیروزین در یک محیط قطبی قرار گرفتهاند. همین روند هنگامی که مهارکننده بهآنزیم اضافه میشود، مشاهده میگردد. در گرافهای به دست آمده بوسیله دستگاه فلورسانس، برانگیختگی در طول موج ، 280 نانومتر در آنزیم خالص حاکی از کوتاه بودن پیک نشر درطول موج 315 نانومتر بود که نشان دهنده حضور تریپتوفانها در سطح پروتئینی آنزیم در محیط قطبی میباشد. با افزودن سوبسترا و مهارکننده به آنزیم افزایش همزمان طول موج و شدت نشر فلورسانس نشان میدهد که زیر واحدهای تریپتوفان از سطح به درون آنزیم نفوذ کرده و از محیط قطبی دور شده و به محیطی غیرقطبی منتقل شدهاند. با توجه به نمودارهای ترسیم شده شدت بر علیه غلظت ترامادول میتوان مشخص نمود که تعداد تریپتوفانها نسبت به تعداد تیروزینها در آنزیم کمتر میباشد. در نهایت از نتایج کینتیکی و ساختاری این مطالعات میتوان اینطور پیشنهاد نمود که اتصال مهارکننده به آنزیم در مکانی به غیر از جایگاه فعال بوده، به طوری که این اتصال سبب تغییر ساختمانی آنزیم شده و موجب مهار غیررقابتی آنزیم میگردد. پیشنهادات : با توجه به اینکه آنزیم آلکالین فسفاتاز آنزیمی است که در بافتهای بدن به خصوص کلیه و کبد فعال است و عملکرد خیلی مهمی دارد به طوری که نقص در این آنزیم ایجاد فرمهای شدید هیپوفسفاتازی و بیماریهای کبدی می نماید و به دنبال بیماری کبدی عملکرد آنزیمی بدن مختل شده که در نهایت منجر به مرگ میشود. در نتیجه پیشنهاد می شود که بررسی این آنزیم بر روی کبد نیز انجام می گیرد و همینطور تغییر ساختمانی آنزیم آلکالین فسفاتاز در کبد مورد بررسی قرار گیرد.